光电关联显微技术基本原理

为了分析复杂的细胞组织的各个方面，对同一样品在不同尺度下观察研究的需求越来越大。光电联用显微技术的巨大潜力在于两种模式的结合：多色标记以及高分辨率结构信息。因此，光电联用显微技术使您能够将两种不同类型的信息——来自荧光显微镜的细胞功能信息和来自电子显微镜的超微结构信息——关联到样品中您感兴趣的同一区域。

这种强大的功能使其成为一项强大的技术，可以在生命科学的多个领域中得到应用，例如神经科学，细胞生物学和组织研究等。近年来，由于亚衍射受限光学显微镜技术开始使用多种技术（例如STORM，PALM，STED和SIM），超高分辨率光学技术的发展进一步提高了光电联用显微技术在生物学研究中的价值。传统的光电联用显微技术执行方法是使用不同的仪器在不同位置获取的这两种不同显微技术的结果，同时用于两个显微技术的样品制备方案也可能不同，然后将获取的成像结果进行关联。这种方法导致工作流程非常耗时，通过有污染样品的风险，并且需要极高水平的专业知识。此外，进行准确的无偏叠加需要一组用于对齐两种模态的独立功能。为了突破执行光电联用显微技术的这些障碍，Delmic开发了一种用户友好的光电联用显微技术解决方案，它使用户能够在一个系统中在光学和电子显微镜对比度之间进行切换，从而增加了光电联用显微技术的功能。

光电联用显微技术（CLEM）使您能够受益于荧光显微镜（FM）的标记功能和电子显微镜（EM）的高分辨率成像功能。使用CLEM意味着您既可以收集FM图像提供的功能信息，也可以收集EM提供的结构信息。此外，您可以基于FM快速选择您感兴趣区域，随后使用EM以高分辨率对其进行成像。

EM和FM的结合不仅可以最大限度地发挥两个显微镜的优势，而且可以极大地掩盖其缺陷。实际上，FM和EM都有其自身的缺点，仅基于EM识别细胞很容易出错，而FM没有足够的分辨率。因此，仅一种显微镜显然不足以提供研究人员进行细胞深度分析所需的全部数据。

图像1：使用安装在Quanta 250 FEG电子显微镜（FEI）上的SECOM系统获得的鸣禽大脑中投射神经元的图像

荧光显微镜

荧光显微镜（FM）因其广泛的标记功能备受众多研究者的青睐。在实验过程中，研究人员可以使用基因编码的荧光蛋白对样品进行染色，免疫标记或标记。此外，由于这些荧光标签的光谱特性，使用不同波长（颜色）的激发光可以同时识别多个标签。通过这种方式，研究人员便可以同时对细胞的多个区域以及各区域不同的细胞功能进行成像，从而形成多色荧光图像。

图像2：HeLa细胞的多色荧光显微镜图像，用Lifeact-mcherry（肌动蛋白）转染并用DAPI（核）伪造。样本由UMC Utrecht的N. Liv提供。

荧光是吸收光子后发光的现象。如图所示，当处于基态的分子吸收光子时，它被激发到一个较高的能量状态，从那里可以衰减到中间的较低能量状态。可用的衰变通道取决于分子及其环境。基态和中间态之间的能量差可以表示为光子，其发射称为荧光。荧光显微镜技术是针对选择性附着于细胞或生物体不同部分的荧光分子的成像。

图像3：荧光团的Jablonski图的示例。此图描绘了致使一个物体将一个波长的光转换为荧光的过程。基态能量状态以蓝色显示。最高的能量状态显示为橙色，而最低的单激发状态显示为红色。

电子显微镜

电子显微镜（EM) 是在纳米尺度下研究物体高分辨率结构的最佳选择。因为加速电子的波长比可见光的波长短得多，所以EM可以克服衍射屏障并且观察更小的细节。

光学显微镜与电子显微镜的区别不仅是分辨率，它们的对比度也非常不同。光学显微镜只能检测已经标记的特定大分子，而电子显微镜主要是获取结构信息。也就是说，通过电子显微镜你可以看到样品上的所有东西。 电子显微镜在生命科学中的应用实例包括了对膜结构例如内质网、高尔基体、和囊泡结构的研究。

图像4：Hela细胞的扫描电子图像

电子显微镜技术是将一束高能电子（通常高达30 keV）聚焦在样品表面上，通常在扫描电子显微镜（SEM）中进行。高能电子束与材料中原子的相互作用会发生许多散射过程，从而导致生成低能二次电子（SE）和高能背散射电子（BSE）等。我们可以通过专用检测器检测这些过程。通过在样品上扫描电子束，可以生成图像。取决于所检测到的电子，图像中会包含与样品有关的各种信息，例如形貌和密度。

图像5：扫描电子显微镜流程图

一体化光电联用显微技术（Integrated CLEM）是一项由Delmic开发的可以将光电联用显微技术在一台仪器上操作完成的独特技术。

通过使用这项技术，您可以在电子显微镜和荧光显微镜之间实现无缝的即刻转换。同时，您再也不同将样本从一个系统转移到同一个系统，只需要将样本装入，您就可以开始精确地关联分析来自您感兴趣的同一细胞或结构的两种不同信息。

一体化光电联用显微技术（Integrated CLEM）将一个荧光显微镜倒置于电子显微镜中。Delmic已经开发出了全世界第一个一体化光电联用显微镜，叫做SECOM。SECOM 可以与任何一台标准化的电子显微镜兼容，只要将SECOM加装到电子显微镜上，就可以轻松操作一体化光电联用显微技术。

图像6：使用了SECOM的光电联用显微技术结构示意图。 扫描电子显微镜的电子束由图中蓝色部分表示。 图中红色和黄色部分呈现的是SECOM系统的光学路径。

关于一体化光电联用显微技术的详细介绍

光电联用显微技术对于研究生命科学的应用十分有帮助，然而同时获取荧光和电子图像却很具有挑战性。请观看以下视频了解Delmic研究开发的这项一体化光电联用显微技术能够如何克服种种挑战。

查看博客或资源中心以获取更多关于一体化光电联用显微技术的信息。

一体化光电联用显微技术的样本制备

一体化光电联用显微技术也是它所面临的挑战，其中之一就是制备同时适用于FM和EM的样品。与此同时，SECOM已经被癌症研究，神经科学和糖尿病等领域的领先研究人员所采用，他们已经成功开发了一体化光电联用显微技术的样品制备技术。这些制备技术可以保存荧光，并为高分辨率成像提供足够的EM对比度。Delmic会提供有关一些一体化光电联用显微技术样品成功制备的案例，旨在帮助您开发出您自己的一体化光电联用显微技术的工作流程。

目前，一体化光电联用显微技术可以在与电子显微镜配合使用的两个平台上使用：SECOM和SECOM SR。通过更换电子显微镜腔室的门，可以在SEM上改装SECOM和SECOM SR平台。这个替换包括了一个电动样本平台以及光学显微镜的物镜和光路。

一体化光电联用显微技术也可以在独立的显微镜DELPHI上实现应用。 DELPHI将台式电子显微镜与一台倒置的电子显微镜结合在一起，这意味着除了DELPHI您不再需要额外的基础设施或设备。它易于安装，并且样品加载时间少于3分钟，整个工作流程十分迅速。DELPHI易于使用且价格实惠，对于所有寻求快速成像的实验室而言都是很好的选择。

请观看下面的视频快速了解使用了SECOM的一体化光电联用显微技术是如何工作的。

传统的光电联用显微技术实施过程中有很多挑战。在一台显微镜与另一台显微镜之间不断地切换很费时，并且经常污染样品。由于这两个显微镜观察到的区域非常的不同，因此准确覆盖两个图像异常重要且容易产生偏差。另外，两种成像技术的样品制备方法也不相同，这意味着在FM和EM中成像的样本并不完全相同。总而言之， 实施CLEM对操作员的熟练程度和研究专长都有很高的要求，而且整个过程非常耗费人力。

一体化光电联用显微技术的问世，克服了传统光电联用显微技术的许多难题：

• 无需转移样本，做到两台显微镜之间的无缝转换
• 自动完成图像叠加，直接对感兴趣的位置进行高分辨率成像
• 再也不用浪费时间在手动叠加两个图像的繁琐工作上
• 图像叠加无比精准, 确保无偏差成像结果

一体化光电联用显微技术旨在帮助生物学研究取得更快更深入地发展, 通过提供同时获取结构和功能信息的解决方案。生命科学的科学研究应该建立在专注于理解生命中的复杂细节上，而不该花费大量的心力在操作复杂的仪器上，因此，生物学研究人员可以从一体化光电联用显微技术所带来的极大简化的研究工作流程和对细胞的强大洞察力中受益。

借助易于使用的一体化光电联用显微技术，您能够以高分辨率直接定位您感兴趣的位置成像并轻松叠加光学和电子显微镜的成像。从而可以将更多的精力放在分析数据和得出结论上，而不用花费大量的时间收集数据。此外，在超分辨率光电联用显微技术系统中，您可以使用基于STORM的技术对标准荧光蛋白进行亚衍射极限成像。总而言之，一体化光电联用显微技术作为一种创新的解决方案，通过逐步扩大研究规模和加快研究速度可以助您回答更多基础研究问题，并在研究领域里取得全新的发现！