冷冻电镜的基本原理

透射电子显微镜（TEM）将电子束透射通过样品以产生图像。当电子通过样品时，一些电子会被样品中较重的原子散射，从而形成投影图像。用电子显微镜对生物材料进行成像需要保护样品免受高真空条件和强电子束的侵害。电子将大量能破坏结构的能量转移到样品中，同时真空则使围绕分子的水蒸发，而保护样品免受这些极端条件影响的方法是冷冻。通过快速冷冻，样品被玻化并呈玻璃状，而不会形成冰晶。在这种状态下，样品变质的速度要慢得多，以便于研究生物材料。

在冷冻电子断层扫描中，被玻璃化的样品在大约倾斜-60⁰ 到 +60⁰的情况下于透射电子显微镜中成像。这产生了一系列可以组合以重建出三维图像的2D图像，即所谓的断层图。此技术功能强大，足以解析细胞环境中处于接近自然状态的细胞内细胞器和蛋白质复合物的3D结构。因为生物分子的位置和结构对于理解其细胞功能至关重要，所以在细胞背景下解析结构是结构生物学和细胞生物学的突破性进展。

通过柱塞冷冻或高压冷冻将样品玻璃化

为了使样品玻璃化，可以使用几种技术，其中最广泛使用的是直插式冷冻和高压冷冻。使用哪种技术主要取决于样品的大小。对于厚度小于10 µm的样品，可以使用冷冻法。在这种方法中，栅格被快速地插入由液氮冷却的致冷剂（例如，液态乙烷）中。对于厚度大于10 µm的样品，通过骤冷无法获得足够高的冷却速率。缓慢的冷冻速度会导致形成冰晶，从而损坏样品。因此，较厚的样本通常使用高压冷冻进行冷冻，该高压冷冻可用于厚度最大为200 µm的样品。在这里，样品在高压（2100 bar）下冷冻，这允许足够的冷冻速度进行玻璃化。

通过冷冻聚焦离子束研磨或冷冻超薄切片术稀释样品

透射电子显微镜的最大分辨率随着样品厚度的增加而缩小。因此，为了获得高分辨率的断层图，样品的理想厚度应在100到300 nm之间。可以使用超薄切片术对玻璃化的样品进行切片：在冷冻条件下用金刚石刀切割样品。然而，该技术具有许多缺点，这些部分倾向于具有物理缺陷、被压缩和起皱，使其难以成像。在样本制备薄切片的最成功技术是所谓的薄片，是使用聚焦离子束（聚焦离子束）进行铣削。通过这种技术，聚焦的镓离子束在高电流下被用于溅射出感兴趣区域周围的材料，从而形成薄片。该过程在配有聚焦离子束的扫描电子显微镜中进行，该聚焦离子束装有冷冻台，可将样品保持在低温下。

通过冷冻荧光显微镜鉴定感兴趣的区域

确定在正确位置进行铣削的感兴趣区域是至关重要的一步，因为超出此过程的目标可能导致铣削您感兴趣的结构。为了克服这个问题，研究者们经常使用冷冻荧光显微镜。在该技术中，对感兴趣的生物分子进行荧光标记，然后首先将样品用冷冻荧光显微镜成像以识别感兴趣区域，聚焦离子束恰好在感兴趣区域处用于在样品中创建薄切片，并将样品转移到冷冻电镜中进行高分辨率成像。这种方法已成为冷冻电子断层扫描的黄金标准，因为它能产生与荧光显微镜高度相关的高分辨率电镜数据，而冷冻条件使样品保持在接近自然状态。但是，这种方法非常费力且容易出错，因为需要在三个不同的显微镜之间转移样品。

通过集成进行优化：将荧光显微镜集成到聚焦离子束或扫描电镜中

如前几节所述，为冷冻电子断层扫描处理样品的最佳方法也是最费力的，过程包括使用三种不同的显微镜。需要将易碎样品从冷冻荧光显微镜转移到冷冻聚焦离子束或扫描电镜，然后再转移到冷冻电镜，同时保持温度低于-160°C。更复杂的是，通常还需要在聚焦离子束研磨后将样品转移回冷冻荧光显微镜，以确认感兴趣区域仍存在于薄切片中。这些转移步骤使工作流程成为一项极具挑战性的任务，因为这些步骤造成了大约只有20％的低样品制备成功率。DELMIC设计了几种产品，这些产品将荧光显微镜技术集成到了冷冻聚焦离子束或扫描电镜系统中，这种设计消除了对单独的冷冻荧光显微镜系统的需要，最重要的是，减少了样本处理。在聚焦离子束或扫描电镜中使用集成的荧光显微镜意味着可以在同一系统中完成通过荧光显微镜进行的感兴趣区域的识别，扫描电镜成像，聚焦离子束铣削和通过荧光显微镜进行感兴趣区域的确认，全过程无需转移样本，从而相当多地提高了冷冻电子断层扫描的成功率。

通过工作流程自动化进行优化：聚焦离子束或扫描电镜的批次传输系统

当前的冷冻电子断层扫描的工作流程是一个复杂而漫长的过程，需要经验丰富的操作员。将荧光显微镜成像集成到聚焦离子束或扫描电镜中可以显著提高成功率，我们还可以做其他更多事情来优化整个工作流程。

许多冷冻电镜可以使用自动装载器系统处理多个样品，但是在其余的冷冻电子断层扫描工作流程中，无法批量制备样品。为了解决这个问题，我们为聚焦离子束或扫描电镜引入了自动样品传输系统。该系统使用的盒子最多可容纳12个栅格，并且与大多数现有的冷冻电镜系统上的自动装载器系统兼容。自动传输系统在真空下工作，无需将样品浸入液氮中即可冷却样品，从而降低了污染风险。这样就产生了一个工作流程，从而消除了在样品玻璃化并装入盒中后手动处理 grids 的需求。因此，极大减少地处理步骤和必要转移意味着在效率和成功率上的重大飞跃。

目前在透射电子显微镜中获得倾斜序列需要20至60分钟，这大大降低了冷冻电子断层扫描的工作流程。幸运的是，新一代的直接检测器，能用于更快的数据传输的硬件以及用于快速倾斜系列的方法已经被开发出来[11]。将这些结合起来，仅需花费当前时间的一小部分就可以获得倾斜序列，从而大大加快工作流程。这种发展也增加了对简便自动的样品制备方法的需求，以最佳地利用冷冻电镜。自动样品制备与高速透射电子显微镜采集相结合，将有可能分辨大量的生物结构。

随着越来越多的结构信息变得可用，我们可以通过自动映射来优化数据处理。根据数据库自动筛选包含几个生物学结构的断层图，已知结构将与断层图中可见的结构拟合，从而显示存在哪些已知结构。同时，常规地获得生物结构也可能导致定量结构生物学的兴起：进行统计分析以加深对结构间差异的了解。

冷冻电子断层扫描将揭示许多细胞过程和途径的结构信息

冷冻电子断层扫描已经向前迈出了一大步：从纯化样品中获得结构数据转变为在生物学环境中或就地获得相同的高分辨率数据。目前，许多研究都集中在大型蛋白质复合物上，这些蛋白质复合物由于其已知的大小或位置而“脱颖而出”，从而使其相对容易识别和成像。随着冷冻电子断层扫描技术的进一步发展，识别越来越稀有的细胞结构和事件将变得更加容易。获得罕见细胞事件的高分辨率结构数据将对诸如药物开发和细胞免疫学等领域产生巨大影响，但也可能重塑许多教科书上对于信号传导途径和细胞运输途径的认识。

即使蛋白质通常以稳定的多蛋白质复合物形式组装，但大多数蛋白质与蛋白质之间的相互作用本质上都是短暂的[12]。这些相互作用通常伴随着蛋白质折叠或形状的变化，从而掌握了有关重要过程的方式和位置的重要信息。目前，在它们的细胞环境中捕获此类瞬态相互作用的结构细节似乎是一项无法获取的技艺，但是随着冷冻电子断层扫描技术的最新发展，可能已不算遥远。

同样，在核酸研究领域中，冷冻电子断层扫描可以发挥基本作用，阐明诸如（非编码）RNA的转录后调控等过程。 RNA二级结构的变化可以直接转化为特定功能，例如基因表达的调节，蛋白质相互作用或RNA-RNA相互作用[13]。自从非编码RNA分子的第一次发现以来，很明显的是，有关RNA分子调节的许多复杂的细胞过程与它们的确认密切相关[14]。在这种情况下，冷冻电子断层扫描可能会进一步揭示RNA在其细胞环境中的结构与功能间关系，而同时挑战在于细胞质中的大量含量和信号RNA分子相对较小的体积。为此，需要增加用冷冻荧光显微镜寻找目标分子的精确度和增加的信噪比，以解决拥挤细胞质中的结构。

在DELMIC，我们坚信冷冻电子断层扫描将彻底改变结构生物学领域，并成为获得生物分子3D结构的首选方法。我们旨在通过提供简化工作流程的解决方案，使研究人员更容易使用冷冻电子断层扫描。为此，我们通过采用自动化方法整合了样品制备工作流程。